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Apogee纳米流式用户连发JEV文章解析外泌体精准分析方法
来源: Admin    更新时间: 2020-04-17    浏览: 65 人次
随着以英国Apogee Flow公司为代表推出纳米流式分析技术的发展,外泌体微囊泡(EVs)采用纳米流式进行快速多参数精准分析的方案,引起越来越多人的关注。使用此方案分析EVs,不仅对所用仪器性能要求很高,样品分离标记等前处理工作也至关重要。由于EVs与脂蛋白颗粒(LPs)大小和密度等方面的分布重叠性,目前尚无特效方法可将其完全分离开。特别是血浆类样品,不仅包含不同血细胞来源的EVs,肿瘤细胞等特异疾病组织来源的EVs,更是包含数量远多于EVs的LPs。目前血浆样品分离提取的EVs,往往伴随着大量未除去的LPs。当前分离技术条件下,采用纳米流式如何更好地对EVs进行单颗粒特异精准分析呢?

荷兰学者Edwin van der Pol之前发表创新研究新成果[1],即通过Apogee纳米流式散射光比例分析法(Flow-SR,不同散射光检测器收集信号的比值),实现对纳米颗粒大小及折射率(RI)进行精准分析。文章指出,由于样品RI不同,不能简单用单一角度散射光直接估算样品大小(图1A和1B,相同强度散射光,不同RI样品,对应直径大小不同)。即使结合Mie光散射理论,可以对特定RI样品进行矫正分析,但是对于EVs来说,由于不同EVs大小及内含物差异,同样是EVs,其RI也是差异显着(一般RI:1.36-1.45之间)。所以直接用单一散射光结合RI矫正进行EVs大小分析,严格来说误差会很大的。

图1,通过Flow-SR分析纳米颗粒大小和折射率

而Flow-SR分析法,在一定大小范围内不受样品折射率的影响,是精准分析EVs大小的更佳方案(图1C)。在此基础上,该研究通过Flow-SR以及相应样品直径大小信息,进一步计算获得不同样品的RI,从而又为不同大小,不同RI的EVs精确分析提供了可能(图2)。

图2,通过Flow-SR分析EVs大小和RI。A,前向角和侧向角散射光分析EVs;B,不同EVs大小及RI分析;C,特异CD61+抗体荧光标记的EVs (大小及RI分析)

荧光标记是EVs精准分析的另一个重要方面。目前,分析特异荧光标记效率的方法,主要有,a)使用抗体isotype同型对照;b)在处不同理样品之间比较;c)选择EVs特异的裂解液。以上这些方法都没有直接分析抗体染料和样品本身(特别是对于混合有LPs和EVs样品)直接的作用情况,实际上仍不是最理想的方案。理论上,使用染料/荧光标记抗体本身做参照直接分析才是更理想的分析方案。Edwin van der Pol又与其他研究小组合作,在上述Flow-SR研究方案基础上,首次将Flow-SR及获得的RI成功应用于EVs特异性荧光标记效率分析[2](图3)。

图3 不同染料对相同EVs和LPs混合类样品进行分析。由于EVs和LPs的折射率明显不同(EVs RI <1.42, LPs RI >1.42),通过Flow-SR及RI分析可精细分析不同染料标记,不同纳米颗粒样品的特异性标记效率

在日前刚发表的另一篇文章中[3],Edwin van der Pol与其他研究人员继续合作,充分利用Apogee纳米流式多角度超灵敏散射光(市场唯一可通过多个角度散射光分析100nm左右EVs样品),通过Flow-SR,来进行纳米颗粒尺寸大小,RI分析,并通过RI信息,进一步区分EVs与LPs(图4),为特异精准分析EVs大小,抗体/染料荧光特异标记效率,提供了更理想的应用方案。

图4 利用Flow-SR分析技术对不同大小EVs和LPs混合样品进行大小,RI和计数分析。左图,圈门区域分析RI<1.42 EVs样品,左图,圈门区域分析RI>1.42 LPs样品

综上所述,以上研究成果在充分利用Apogee超灵敏纳米流式分析仪对EVs传统应用方案基础之上,突破了仅用一个角度超灵敏散射光进行纳米颗粒检测的应用限制,进一步成功开发新的Flow-SR特色分析技术,将超灵敏纳米流式多角度散射光比例分析(Flow-SR)用于外泌体微囊泡大小,折射率以及荧光特异性标记效率分析。利用Flow-SR分析技术获得直径大小及折射率信息,不仅为区分未去除的脂蛋白纳米颗,精准分析外泌体微囊泡,也为其他纳米颗粒类样品提供了纳米流式分析前沿应用方案。


参考资料
1. van der Pol E, de Rond L, Coumans FAW, et al. Absolute sizing and label-free identification of extracellular vesicles by flow cytometry. Nanomedicine. 2018
2, de Rond L, Libregts SFWM, Rikkert LG, et al. Refractive index to evaluate staining specificity of extracellular vesicles by flow cytometry. J Extracell Vesicles. 2019
3, Agustin Enciso-Martinez, Edwin Van Der Pol, Chi M. Hau, et al. Label-free identification and chemical characterisation of single extracellular vesicles and lipoproteins by synchronous Rayleigh and Raman scattering. J Extracell Vesicles. 2020

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